Gerda
aneb genetika na koleně
Gerda je jméno robota, který provádí rutinní genetické testy s DNA. Asi bych moc nevěřil tomu, že jednou budu sestavovat robota ze stavebnice Merkur a ještě za to budu placený . Požadavky ale byly nekompromisní: cenová nenáročnost a rychlost zpracování – jak to bude vypadat, tak na tom až tak nezáleží. Cíl je ověřit předpoklady a časování některých genetických testů pro nově vznikající laboratoř firmy GenDetective s.r.o.
Cíl
Gerda měla za úkol namáčet destičku se vzorky postupně ve třech nádobách. Tento
sled operací je třeba opakovat 30 až 50 krát s relativně přesným čekáním v
každé jednotlivé nádobě tj. rozhodně to není práce pro normálního člověka.
Destička má rozměry zhruba 12x9x1cm a její fyzikální vlastnosti lze simulovat
pomocí kousku polystyrénu (během vývoje robota vznikal i nový typ desky se
vzorky, která má vyrazně jiné vlastnosti, ale to využije až další generace
Gerdy). V nádobách je pak voda o magických teplotách 94°C, 54°C, 74°C.
Slepé cestičky
První experimentální posun byl realizován pomocí poháněné tyče se závitem,
kdy pojezd byl pevně
spojen s matkou. Závitovou tyč délky 1m lze pořídit snad v každém železářství
a stejně tak matky M8. Toto řešení bylo sice poměrně levné (desítky korun), ale
pohyb byl extrémě pomalý. Dalším potenciálním problémem byla koroze závitové
tyče a matek.
Další verze byla založena na řemenech: jednalo se v podstatě o 2D kartézského
robota. Ani tato varianta nebyla dotažena do konce, protože se ukázalo, že
pojezd v horizonálním směru lze řešit přímo na vozíku a není tedy nijak
omezován velikostí řemenu. Pojezd ve vertikálním směru řemen řešil dostatečně
(jak rychlostí zdvihu, tak sílou tahu).
První funkční verze Gerdy používala doraz pro určení první nádoby a přesné
časování pro přejezd ke druhé a třetí nádobě. Toto řešení kupodivu fungovalo,
protože rychlost posunu byla rovnoměrná. Zároveň bylo jasné, že libovolný
podkluz nebo vnější zásah celý cyklus poruší, a tak bylo snazší dořešit detekci
pozice u druhé a třetí nádoby než ošetřovat výjimečné situace.
Výsledná konstrukce robota
 Nový vozík |
Tato verze fungovala relativně spolehlivě s nádobami s vodou a polystyrénovou
destičkou simulující vzorky. V dalších testech na sucho se ale začalo
projevovat přílišné tření vozíku (pohyb nahoru/dolů) a problematické napínání
řemenu. Problém byl řešen otočením osy koleček o 90°, kdy kolečka v nové poloze měla daleko
menší tření. Konečně není třeba nějaká přesná kolejnice, ale stačí volně
pohybující se kola a upevnění řemenem. Napínání řemenu pak bylo řešeno přímo na
vozíku pomocí pozice úchytů.
Jelikož robot není uplně malinký (výsledný rám měl 38x62cm), tak jako základ
byly použity hliníkové profily (v celkové délce cca 10 metrů). Stavebnice
Mekrur posloužila v první fázi pro experimentovaní s pojezdy a nakonec se stala
i součastí výsledného prototypu.
Řízení a elektronika
Pro pohony byla použita modifikovaná modelářská serva. K jejich ovládání
postačila deska s ATmega8, stejná jako je v robotovi
Faethon nebo v robotech Ferda a
Fatima. Pro různé testy je třeba nastavovat odlišné časy, jak dlouho
mají vzorky setrvat v každé z nádob. Nejjednodušší řešení bylo pomocí
připojeného PC. Řídicí program a nastavení časů zajišťovalo PC, které pak komunikovalo
s jednočipem pomocí RS-232. V
budoucnu by neměl být problém vše přesunout do jednočipu s tím, že by bylo třeba
doplnit ovládací prvky (klávesnici a LCD).
Senzory tvořily čtyři mikrospínače, pro detekci levého dorazu, 2. a 3. nádoby
a konečně pro horní a spodní limit zdvihacího mechanismu. Celý automat byl
napájen pulsním zdrojem 5V/1.5A, pořízeném v GM Electronics, který byl společný
pro serva i elektroniku.
Genetika…
Genetika aneb co se dejě ve vzorcích šplouchající Gerdy?
Dochází zde k PCR
(Polymerase chain reaction — polymerázová řetězová reakce),
která je velmi dobře popsaná např. v knize
Základy buněčné biologie (Úvod do molekulární biologie buňky) Alberts,
Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter ISBN 80-902906-0-4. Tato kniha vyšla v
češtině zhruba před pěti lety a popsanou metodu zde z ní částečně ocituji (str. 333).
Metoda PCR se používá už více jak patnáct let pro izolaci
genů a mnohé další aplikace technologie DNA. Probíhá zcela v podmínkách in
vitro (latinsky „ve skle”), tedy bez použití buněk. Pomocí této techniky může být rychle a vysoce
selektivně namnožena konkrétní nukleotidová sekvence obsažená v jakékoli DNA.
Polymerázová řetězová reakce je v dnešní době široce používána, například v
diagnostice při analýze genetických chorob nebo pro namnožení jakéhokoliv genu
z malého vzorku DNA.
Základní pojmy
- nukleotid
- základní stavební kamen DNA: {adenin | cytosin | guanin | thymin} + cukr a fosfát
- polynukleotid
- objekt skládající se z velkého počtu nukleotidů
- oligonukleotid
- objekt skládající se z malého počtu nukleotidů (typicky 20 a méně)
- DNA
- dvouvláknový polynukleotid, který slouží jako nosič genetické informace.
- komplementární řetězec
- doplňkový řetězec, kde jsou prohozeny guanin s cytosinem a adenin s thyminem
- primer
- oligonukletotid, který hraje roli startovního bloku pro doplnění komplementárního řetězce DNA daným směrem (na obrázcích červené a zelené značky se směrem naznačeným zkosením)
- polymeráza
- představte si automat, který od značky (primeru) doplňuje chybějící kus druhé (komplementární) DNA
Namnožení DNA pomocí PCR
Na základě znalosti sekvence DNA, kterou chceme namnožit, jsou nasyntetizovány
dva primery. Každý z nich je komplementární k jednomu konci požadované
sekvence. Začínáme s dvouřetězcovou DNA. V prvním kroku od sebe oba řetězce
oddělíme krátkým zvýšením teploty na 94°C. V druhém kroku snížíme teplotu na
54°C. V tomto okamžiku na rozdělené řetězce nasedají oba druhy primerů. Na
obrázku jsou označeny jako krátké červené a zelené značky. Ve třetím kroku se
nám z těchto „startovních” pozic díky přítomnosti polymerázy „dorostou”
komplementární řetězce, které máme na obrázku označeny čevenými a zelenými
proužky. Další cyklus je pak znovu zahájen oddělením dvojřetězců zvýšenou
teplotou.
Celá technika je založena na použití speciální DNA-polymerázy, která byla
izolována z termofilní bakterie [tj. z bakterie, která má ráda teplo]; tato
polymeráza je stabilní i při mnohem vyšších teplotách, takže není rozložena
vysokou teplotou v prvním kroku, a nemusí být tedy přidávána na každém cyklu
reakce.
Jak je ukázáno na obrázku, produktem tří cyklů je 16 jednoduchých řetězců DNA,
z nichž 8 má požadovanou délku [na obrázku jsou očíslovány]. Z těchto 8 řetězců
budou v dalších cyklech vznikat pouze jejich přesné kopie (oba konce jsou
ohraničeny primery). 6 řetězců má ohraničen pouze jeden konec, a proto z nich
v dalších cyklech mohou vznikat buď jejich kopie, anebo požadované
kratší řetězce, v závislosti na tom, který z primerů se k nim připojí. Zbývají
dva původní dlouhé řetězce z nichž vznikají řetězce s jedním ohraničením.
V dalších cyklech reakce slouží tedy i nově vytvořené molekuly DNA jako vzory pro
množení a během několika málo cyklů začnou v roztoku převažovat namnožené
sekvence ohraničené z obou stran primery. Obykle se
pro množení používá 20-30 cyklů, přičemž se v každém cyklu množství molekul
oproti přecházejícímu cyklu zdvojnásobí. Jelikož jeden cyklus trvá přibližně
pět minut, a protože byla celá technika zautomatizována, je nyní možno
naklonovat fragment DNA označený primery bez použití buněk během několika hodin
na rozdíl od několikadenního standardního postupu.
Video - test s vodou
Závěr
Gerda je celkem jednoduchý robot, pomocí kterého lze realizovat rutinní
opakování PCR metody. Snad je to dostatečný příklad toho, že i s jednoduchým
strojem lze dělat velmi zajímavé experimenty.
Pokud vám některá část přišla méně srozumitelná nebo jste našli chybu či
nesrovnalost, ale i v případě, že se vám vše líbilo a chcete nás pouze
povzbudit, využijte našeho
kontaktního formuláře.