czech english

Gerda

aneb genetika na koleně

Gerda je jméno robota, který provádí rutinní genetické testy s DNA. Asi bych moc nevěřil tomu, že jednou budu sestavovat robota ze stavebnice Merkur a ještě za to budu placený . Požadavky ale byly nekompromisní: cenová nenáročnost a rychlost zpracování – jak to bude vypadat, tak na tom až tak nezáleží. Cíl je ověřit předpoklady a časování některých genetických testů pro nově vznikající laboratoř firmy GenDetective s.r.o.

Cíl

Gerda měla za úkol namáčet destičku se vzorky postupně ve třech nádobách. Tento sled operací je třeba opakovat 30 až 50 krát s relativně přesným čekáním v každé jednotlivé nádobě tj. rozhodně to není práce pro normálního člověka. Destička má rozměry zhruba 12x9x1cm a její fyzikální vlastnosti lze simulovat pomocí kousku polystyrénu (během vývoje robota vznikal i nový typ desky se vzorky, která má vyrazně jiné vlastnosti, ale to využije až další generace Gerdy). V nádobách je pak voda o magických teplotách 94°C, 54°C, 74°C.

Slepé cestičky

První experimentální posun byl realizován pomocí poháněné tyče se závitem, kdy pojezd byl pevně spojen s matkou. Závitovou tyč délky 1m lze pořídit snad v každém železářství a stejně tak matky M8. Toto řešení bylo sice poměrně levné (desítky korun), ale pohyb byl extrémě pomalý. Dalším potenciálním problémem byla koroze závitové tyče a matek.
Další verze byla založena na řemenech: jednalo se v podstatě o 2D kartézského robota. Ani tato varianta nebyla dotažena do konce, protože se ukázalo, že pojezd v horizonálním směru lze řešit přímo na vozíku a není tedy nijak omezován velikostí řemenu. Pojezd ve vertikálním směru řemen řešil dostatečně (jak rychlostí zdvihu, tak sílou tahu).
První funkční verze Gerdy používala doraz pro určení první nádoby a přesné časování pro přejezd ke druhé a třetí nádobě. Toto řešení kupodivu fungovalo, protože rychlost posunu byla rovnoměrná. Zároveň bylo jasné, že libovolný podkluz nebo vnější zásah celý cyklus poruší, a tak bylo snazší dořešit detekci pozice u druhé a třetí nádoby než ošetřovat výjimečné situace.

Výsledná konstrukce robota

Nový vozík
Nový vozík
Konečná verze používala ozubený řemen pro posun nahoru a dolu. K detekci krajních poloh byly použity mikrospínače. I pozici pro 2. a 3. nádobu řešil mikrospínač — ideální se ukázal „velký mikrospínač” s prodlouženým ramenem, na které lze doplnit oblý nárazník. Ten umožnuje volný přejezd oběma směry. Pozice je pak určena prvním stiskem při jízdě od dorazového spínače.
Tato verze fungovala relativně spolehlivě s nádobami s vodou a polystyrénovou destičkou simulující vzorky. V dalších testech na sucho se ale začalo projevovat přílišné tření vozíku (pohyb nahoru/dolů) a problematické napínání řemenu. Problém byl řešen otočením osy koleček o 90°, kdy kolečka v nové poloze měla daleko menší tření. Konečně není třeba nějaká přesná kolejnice, ale stačí volně pohybující se kola a upevnění řemenem. Napínání řemenu pak bylo řešeno přímo na vozíku pomocí pozice úchytů.
Jelikož robot není uplně malinký (výsledný rám měl 38x62cm), tak jako základ byly použity hliníkové profily (v celkové délce cca 10 metrů). Stavebnice Mekrur posloužila v první fázi pro experimentovaní s pojezdy a nakonec se stala i součastí výsledného prototypu.

Řízení a elektronika

Pro pohony byla použita modifikovaná modelářská serva. K jejich ovládání postačila deska s ATmega8, stejná jako je v robotovi Faethon nebo v robotech Ferda a Fatima. Pro různé testy je třeba nastavovat odlišné časy, jak dlouho mají vzorky setrvat v každé z nádob. Nejjednodušší řešení bylo pomocí připojeného PC. Řídicí program a nastavení časů zajišťovalo PC, které pak komunikovalo s jednočipem pomocí RS-232. V budoucnu by neměl být problém vše přesunout do jednočipu s tím, že by bylo třeba doplnit ovládací prvky (klávesnici a LCD).
Senzory tvořily čtyři mikrospínače, pro detekci levého dorazu, 2. a 3. nádoby a konečně pro horní a spodní limit zdvihacího mechanismu. Celý automat byl napájen pulsním zdrojem 5V/1.5A, pořízeném v GM Electronics, který byl společný pro serva i elektroniku.

Genetika…

Genetika aneb co se dejě ve vzorcích šplouchající Gerdy? Dochází zde k PCR (Polymerase chain reaction — polymerázová řetězová reakce), která je velmi dobře popsaná např. v knize Základy buněčné biologie (Úvod do molekulární biologie buňky) Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter ISBN 80-902906-0-4. Tato kniha vyšla v češtině zhruba před pěti lety a popsanou metodu zde z ní částečně ocituji (str. 333). Metoda PCR se používá už více jak patnáct let pro izolaci genů a mnohé další aplikace technologie DNA. Probíhá zcela v podmínkách in vitro (latinsky „ve skle”), tedy bez použití buněk. Pomocí této techniky může být rychle a vysoce selektivně namnožena konkrétní nukleotidová sekvence obsažená v jakékoli DNA. Polymerázová řetězová reakce je v dnešní době široce používána, například v diagnostice při analýze genetických chorob nebo pro namnožení jakéhokoliv genu z malého vzorku DNA.

Základní pojmy

nukleotid
základní stavební kamen DNA: {adenin | cytosin | guanin | thymin} + cukr a fosfát
polynukleotid
objekt skládající se z velkého počtu nukleotidů
oligonukleotid
objekt skládající se z malého počtu nukleotidů (typicky 20 a méně)
DNA
dvouvláknový polynukleotid, který slouží jako nosič genetické informace.
komplementární řetězec
doplňkový řetězec, kde jsou prohozeny guanin s cytosinem a adenin s thyminem
primer
oligonukletotid, který hraje roli startovního bloku pro doplnění komplementárního řetězce DNA daným směrem (na obrázcích červené a zelené značky se směrem naznačeným zkosením)
polymeráza
představte si automat, který od značky (primeru) doplňuje chybějící kus druhé (komplementární) DNA

Namnožení DNA pomocí PCR

Na základě znalosti sekvence DNA, kterou chceme namnožit, jsou nasyntetizovány dva primery. Každý z nich je komplementární k jednomu konci požadované sekvence. Začínáme s dvouřetězcovou DNA. V prvním kroku od sebe oba řetězce oddělíme krátkým zvýšením teploty na 94°C. V druhém kroku snížíme teplotu na 54°C. V tomto okamžiku na rozdělené řetězce nasedají oba druhy primerů. Na obrázku jsou označeny jako krátké červené a zelené značky. Ve třetím kroku se nám z těchto „startovních” pozic díky přítomnosti polymerázy „dorostou” komplementární řetězce, které máme na obrázku označeny čevenými a zelenými proužky. Další cyklus je pak znovu zahájen oddělením dvojřetězců zvýšenou teplotou.
Celá technika je založena na použití speciální DNA-polymerázy, která byla izolována z termofilní bakterie [tj. z bakterie, která má ráda teplo]; tato polymeráza je stabilní i při mnohem vyšších teplotách, takže není rozložena vysokou teplotou v prvním kroku, a nemusí být tedy přidávána na každém cyklu reakce.
Jak je ukázáno na obrázku, produktem tří cyklů je 16 jednoduchých řetězců DNA, z nichž 8 má požadovanou délku [na obrázku jsou očíslovány]. Z těchto 8 řetězců budou v dalších cyklech vznikat pouze jejich přesné kopie (oba konce jsou ohraničeny primery). 6 řetězců má ohraničen pouze jeden konec, a proto z nich v dalších cyklech mohou vznikat buď jejich kopie, anebo požadované kratší řetězce, v závislosti na tom, který z primerů se k nim připojí. Zbývají dva původní dlouhé řetězce z nichž vznikají řetězce s jedním ohraničením.
V dalších cyklech reakce slouží tedy i nově vytvořené molekuly DNA jako vzory pro množení a během několika málo cyklů začnou v roztoku převažovat namnožené sekvence ohraničené z obou stran primery. Obykle se pro množení používá 20-30 cyklů, přičemž se v každém cyklu množství molekul oproti přecházejícímu cyklu zdvojnásobí. Jelikož jeden cyklus trvá přibližně pět minut, a protože byla celá technika zautomatizována, je nyní možno naklonovat fragment DNA označený primery bez použití buněk během několika hodin na rozdíl od několikadenního standardního postupu.

Video - test s vodou

Závěr

Gerda je celkem jednoduchý robot, pomocí kterého lze realizovat rutinní opakování PCR metody. Snad je to dostatečný příklad toho, že i s jednoduchým strojem lze dělat velmi zajímavé experimenty.
Pokud vám některá část přišla méně srozumitelná nebo jste našli chybu či nesrovnalost, ale i v případě, že se vám vše líbilo a chcete nás pouze povzbudit, využijte našeho kontaktního formuláře.